【卒中研究】银杏二萜内酯(GK)通过激活JAK2/STAT3通路发挥脑缺血再灌注后促血管再生作用
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前 言
脑卒中是一种以脑部缺血和出血为主要损伤症状的疾病，分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中两大类，其中缺血性脑卒中占发病率的80%之多，也是导致残疾及痴呆的重要原因之一。脑组织缺血数秒至数分钟后即触发缺血级联反应，包括早期氧供减少、兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、梗死区周围去极化及后期的血脑屏障损坏、缺血后炎症及细胞死亡。各事件在缺血后相互重叠，相互影响。缺血级联反应及脑损伤范围取决于缺血程度及持续时间。
JAK2/STAT3信号通路是参与细胞增殖分化、细胞炎症、肿瘤等多种生理病理过程的细胞内信号转导通路 。JAK是一类胞质内非受体型酪氨酸蛋白激酶，而STAT是一类能与靶基因调控区DNA结合的胞质类蛋白家族。胞外信号与靶细胞上受体结合后，首先激活蛋白激酶JAK2，活化的JAK2能磷酸化胞质中的信号转导和转录激活因子(STAT3 )，两个磷酸化的STAT3分子结合形成二聚体后转位到细胞核，与相应的靶基因调控区DNA结合，触发下游靶基因的表达。在脑缺血急性期，STAT3能通过抑制神经元凋亡和氧化应激发挥神经保护作用，从而减小脑梗死体积。
以下研究旨在应用小鼠tMCAO模型，探究银杏二萜内酯（GK）对脑缺血再灌注后修复期的保护作用及其对梗死侧半影区血管再生的影响，同时在体外运用小鼠微血管内皮细胞OGD/R模型，探讨银杏二萜内酯（GK）对血管内皮细胞的保护作用，并进一步阐明了其发挥促血管再生的相关机制，丰富了银杏二萜内酯（GK）的药理作用研究，为其临床开发和应用提供了依据。
研究设计
1. 动物分组与给药(1)GK对tMCAO模型小鼠脑缺血再灌注14天损伤的药效学研究和对血管再生影响的研究:根据实验室前期工作基础，确定本研究中小鼠GK三个剂量组分别为3.5, 7.0, 14.0 mg/kg, ip.Bid.，阳性对照药银杏二萜内酯 (GB)剂量为3.5 mg/kg，受试药临用前以无菌生理盐水稀释。于缺血再灌注后1h时腹腔给药14天。模型对照(Vehicle )组同时给予无菌生理盐水。(2)GK对tMCAO小鼠缺血再灌注后血管再生机制的研究:小鼠随机分为伪手术组(Sham )，GK单给药组(3.5 mg/kg )，模型对照组(Vehicle )，GK治疗组(3.5 mg/kg)。受试药临用前以无菌生理盐水稀释。于缺血性再灌注后1h时腹腔给药，共给药14天。模型对照组(Vehicle )和伪手术组(Sham)同法给予无菌生理盐水。2. 实验方法应用C57BL/6小鼠制备tMCAO模型，研究银杏二萜内酯(GK)对小鼠脑缺血再灌注损伤14天后的保护作用，同时观察其对梗死侧半影区血管再生的影响;并离体培养小鼠微血管内皮细胞，验证GK促血管再生作用，探讨GK发挥促血管再生作用与JAK2/STAT3通路和VEGF的相关性。
研究结果
1.银杏二萜内酯(GK)减少1４天脑缺血后的脑梗死面积图片
结果显示：
Sham组小鼠大脑冠状面MRI-T2加权像左右皮层、纹状体和海马对称，无梗死。tMCAO模型组小鼠MRI图像则出现右侧脑组织部分高亮及边缘发黑的现象，且右脑组织有明显萎缩现象，此区域即为模型所致的梗死样病灶，其梗死体积百分比约为23.28%，阳性药GB 3.5mg/kg能显著减小小鼠脑梗死体积(脑梗死体积比为18.17%)，GK 3.5mg/kg, 7.0mg/kg, 14.0 mg/kg治疗组均能够显著减小小鼠脑梗死体积，随着GK给药剂量的增加，其脑梗死体积比依次约为17.35%, 15.81%, 14.23%。提示：银杏二萜内酯（GK）改善脑缺血再灌注后修复期损伤，减小脑梗死体积。
2.银杏二萜内酯（GK）改善脑缺血后的运动功能和神经损伤图片
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结果显示：
（1）tMCAO造模后第一天，各组小鼠损伤程度基本相同，随着时间的推移，各分组小鼠的神经功能评分均呈递减趋势，且给药组下降趋势明显优于模型组，GK（14.0 mg/kg)下降最明显。
（2）第14天转角测试，结果显示，Sham组小鼠向左向右扭转的频率基本相当(右转率约为48.75% )，tMCAO模型组小鼠右转率则较Sham组显著增加，约为75.76%，给予GB（3 .5mg/kg )、GK （ 3.5 mg/kg, 7.0 mglkg,14.0 mg/kg)治疗后，其右转率相较模型组呈现显著降低趋势，右转率分别为61.43%, 60%, 53%. 51.43%，可见，当GK给药剂量为7.0 mg/kg, 14.0 mg/kg时，小鼠的右转率基本恢复到Sham组水平。 （3）第14天的转棒实验中，Sham组运动协调能力正常，能在转棒(15 rpm/min )上保持至少300 s，模型组转棒维持时间显著减少145.44s±5.84s，GB阳性药组和GK三个治疗剂量组转棒维持时间较模型组均显著增加(分别为214.57s±7.32 s, 221.17±4.11s, 256.1s±3.56s, 285s±3.54s)。提示：银杏二萜内酯（GK）能改善脑缺血再灌注后的运动功能和神经损伤。
3.银杏二萜内酯（GK）减轻脑缺血再灌注14天后血脑屏障的破坏
为了观察GK能否减轻血脑屏障通透性的破坏，我们运用免疫组化检测了各组小鼠IgG渗漏情况和collagen-IV的形态改变。IgG作为一种大分子蛋白，正常情况下不能通过血脑屏障，当血脑屏障破坏后，血浆中的IgG会渗漏到脑组织中。图片
结果显示：
正常组小鼠脑片完整，无IgG渗漏，脑缺血再灌注14天后，模型组小鼠右脑IgG渗漏严重，给予阳性药GB(3.5 mg/kg)和GK三个剂量后，小鼠大脑IgG渗漏减轻。GK对脑缺血后血脑屏障的损伤具有改善和保护作用。
提示：银杏二萜内酯（GK）脑缺血后血脑屏障的损伤具有改善和保护作用。
4.银杏二萜内酯（GK）促进侧脑血流的恢复
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结果显示：
在tMCAO模型完成14天后，应用多普勒血流仪监测小鼠大脑局部脑血流(rCBF )，以伪手术组小鼠rCBF为基准(Baseline,100% )，模型组rCBF约为基础值的71.24%，给予阳性药GB ( 3.5mg/kg)后，rCBF恢复到约为基础值的80.40%，给予治疗药GK3.5mg/kg, 7.0mg/kg, 14.0mg/kg三个剂量后，rCBF分别恢复至基础值的80.58%. 89.86%, 94.44%。
提示：银杏二萜内酯（GK）具有促进缺血再灌注后小鼠损伤侧脑血流恢复的作用。
5.银杏二萜内酯（GK）促进缺血再灌注后损伤侧半影区血管再生
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结果显示：
多普勒血流仪监测结果提示，GK能促进小鼠缺血半球脑血流恢复，为了研究GK是否具有促进血管再生作用，本文采用Glut 1/Ki67免疫荧光共标法标记新生的血管，Glut 1高表达于脑内血管内皮细胞，用于标记脑内血管，Ki67用于标记增殖细胞，Glut 1 /Ki67 代表新生的血管，实验结果显示，在正常小鼠脑片中，血管分布丰富，缺血损伤后，模型组半影区血管破坏严重，新生血管较少，给予GK治疗后，半影区血管密度较模型组有显著改善，新生血管数目显著增加。提示：银杏二萜内酯（GK）脑卒中的保护作用可能与促进缺血再灌注损伤半影区血管再生相关。
6. 银杏二萜内酯（ＧＫ）上调缺血半影区HIF-1a、VEGF的表达
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结果显示：
RT-PCR结果显示，缺血再灌注14天后，小鼠大脑右侧损伤半影区HIF-1 a和VEGF的mRNA水平较Sham组显著升高，给予GK治疗后，HIF-1a和VEGF的mRNA表达量又较tMCAO模型组进一步上调，差异具有统计学意义。Western Blot检测结果趋势与RT-PCR一致。提示：银杏二萜内酯（GK）能上调缺血再灌注损伤后大脑内的HIF-1 a和VEGF表达，从而促进半影区血管再生。
7.银杏二萜内酯（GK）减轻微血管内皮细胞（bEnd３）损伤
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结果显示：
给予不同浓度的GK ( 0.1,1,10,50100μM)预孵育小鼠微血管内皮细胞(bEnd3 ) 2小时，氧糖剥夺3小时，复糖复氧后正常培养24小时，随后分别对细胞和上清进行处理，检测MTT和LDH。实验结果显示，OGD/R刺激后，随着GK给药浓度的升高，细胞活力呈上升趋势，LDH释放呈下降趋势，当GK给药浓度达到1 μM时，能显著减少LDH的释放;GK浓度达到10μM时，既能抑制LDH释放，也显著改善OGD/R所致的细胞活力下降。因此，后续实验选择10 μM的GK给药浓度进行机制研究。提示：银杏二萜内酯（GK）减轻OGD／R所致的小鼠微血管内皮细胞（ｂEnd３）损伤。
8. 银杏二萜内酯（GK）上调微血管内皮细胞HIF-1a、VEGF表达
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结果显示：
给予10 μM的GK预孵育b End3细胞2h，氧糖剥夺3h，复糖复氧培养6h后，收集细胞，RT-PCR检测HIF-la, VEGFmRNA水平。结果显示(Fig. 9 A,B)，OGD/R后，HIF-1a, VEGF的mRNA水平较正常对照组显著上调，给予GK后，HIF-1a和VEGF的mRNA表达量又较OGD/R模型组进一步升高，差异具有统计学意义。同时本文检测了相同处理条件下，b End3细胞复糖复氧培养24 h后，HIF-1 a和VEGF的蛋白表达水平(Fig.10A, B)，其趋势与RT-PCR一致。提示：银杏二萜内酯（GK）能上调OGD/R后b End3细胞HIF-1 a和VEGF表达。
9.银杏二萜内酯（GK）激活微血管内皮细胞JAK2/STAT3通路
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结果显示：
给予10μM的GK预孵育b End3细胞2 h,氧糖剥夺3 h,复糖复氧培养24h后，收集细胞，Western Blot检测JAK2, p-JAK2, STAT3, p-STAT3的蛋白水平，结果显示，缺血再灌注损伤后，JAK2, STAT3蛋白水平较Sham组无显著变化，p-JAK2, p-STAT3的蛋白水平则较Sham组显著上调。给予GK治疗后，JAK2, STAT3蛋白表达依然维持在正常水平，而p-JAK2, p-STAT3的蛋白水平较OGD/R模型组进一步上调，差异具有统计学意义。提示：OGD/R后给予银杏二萜内酯（GK）能激活JAK2/STAT3通路。
10.银杏二萜内酯（GK）能促进内皮细胞存活和血管腔形成
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结果显示：
给予10 μM的GK预孵育b End3细胞2h，氧糖剥夺3h，复糖复氧培养24h后，VEGF细胞免疫荧光观察b End3细胞形态变化。如图所示，细胞在正常培养条件下，呈梭状紧密相连，且会自发形成圆形管腔。OGD/R后，细胞出现皱缩、坏死，细胞核肿胀，细胞间连接断裂，圆形管腔遭到破坏。给予GK处理后，细胞存活率升高，细胞形态得到改善，且能维持圆形管腔的形成。当给予GK处理的同时给予JAK2抑制剂AG490 (10μM )，GK的保护作用被取消，细胞间连接破坏，难以维持完整的圆形管腔。
提示：银杏二萜内酯（GK）促进OGD/R后内皮细胞存活和血管腔形成。
11.银杏二萜内酯（GK）对HIF-la, VEGF,p-JAK2, p-STAT3的上调作用与JAK2/STAT3通路有关
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结果显示：
在b End3细胞上预给予JAK2抑制剂AG490(10 wM )，再给予GK(10μM)并进行OGD/R,Western Blot结果显示(Fig. 13 A, B, C, D, E )，GK可以上调OGD/R后HIF-1a，VEGF, p-JAK2, p-STAT3的表达，预给予JAK2抑制这种上调作用被部分取消。提示：银杏二萜内酯（GK）对HIF-1 a和VEGF的上调作用与JAK2/STAT3通路的激活有关。
讨 论
GK是从银杏叶中提取出的一种新的银杏二萜内酯类成分。本文主要探讨GK对小鼠脑缺血再灌注14天的保护作用，观察GK对缺血半影区血管再生的影响。研究结果显示，GK具有减轻tMCAO模型小鼠14天脑损伤、促进神经运动功能恢复的作用，且能促进缺血半影区血管再生，帮助脑血流恢复。以上结果确证GK能通过促进小鼠脑缺血再灌注损伤后血管再生发挥修复期保护作用。
血管再生是神经血管单元修复的一个重要内容。本文观察了GK对脑缺血再灌注14天后的小鼠梗死侧脑血流恢复和血管再生的影响，发现GK确实能够促进小鼠tMCAO模型损伤后的脑血流恢复和半影区血管再生，显著减小梗死体积。
脑卒中发生后，小鼠机体会自发性的升高HIF-1 a和VEGF的表达，发挥内源性促血管再生作用，然而由于机体本身功能的局限性，该代偿性的升高VEGF的作用，不足以对抗脑缺血所造成的血管损伤，GK可进一步上调受损的脑组织中VEGF的表达，发挥外源性促血管再生的作用。同时b End3细胞在氧糖剥夺条件下，会代偿性激活JAKZlSTAT3通路，发挥自体保护作用，本研究证实GK进一步激活JAK2/STAT3通路，增强细胞对抗氧糖剥夺损伤的能力。
结 论
银杏二萜内酯（GK）研究显示：1.GK能减少14天脑缺血后脑梗死面积；2.GK能改善脑缺血后的运动功能和神经损伤；3.GK能减轻脑缺血再灌注后血脑屏障的破坏；4.GK能促进侧脑血流的恢复；5.GK能促进缺血再灌注后损伤侧半影区血管再生；6.GK能上调缺血半影区及微血管内皮细胞中HIF-1a、VEGF的表达；7.GK能减轻微血管内皮细胞（bEnd3）损伤；8.GK能激活微血管内皮细胞JAK2/STAT3通路；9.GK能促进内皮细胞存活和血管腔形成；10.GK对HIF-1a和VEGF的上调作用与JAK2/STAT3通路的激活有关。综上所述，银杏二萜内酯(GK)可通过促进脑缺血再灌注损伤修复期血管再生发挥保护作用，其促血管再生作用与激活JAK2/STAT3通路上调VEGF的表达相关。南京医科大学
2017年5月
【论文作者】陈萌，女，南京医科大学（NO.10312）硕士,专业为药理学
【论文导师】胡刚教授，男，南京中医药大学校长，博士生导师
【本文编辑】仙人掌
参考文献
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